約30年間、抗原を担う分子が解明されなかったKANNO抗原ですが、ゲノムワイド関連解析（GWAS）を用いた手法によって、第20番染色体短腕（20p13）のPRNP遺伝子にコードされたプリオン蛋白上に存在することがようやく分かりました。プリオン遺伝子（PRNP遺伝子）の655番塩基に一塩基置換（c.655G＞A）を持つ遺伝子をホモ接合で持つ個体がKANNO-の表現型になります。ここでは、KANNO抗原を担うプリオン蛋白の（はてな？）についてシェアしたいと思います。
KANNO抗原がプリオン蛋白上に存在していることを確認するため、MAIEA（Monoclonal antibody-specific immobilization of erythrocyte antigen）法を用いて確認しています。詳細は下のMAIEA法の原理（模式図）を参照ください。概要を簡単に説明すると、この方法はマイクロプレートの底にマウス抗IgGを固相し、次に未知の抗原蛋白を検出するために、特異性が既知の抗体を結合させます（特異性の異なる複数の抗体を準備）。抗原を結合させた後に、検出目的の抗原に対する同種抗体（ここでは抗KANNO）を結合させた後にペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgGで二次架橋し、発色の程度から抗体が反応する蛋白を推測するという原理です。つまり、一次抗体（特異性が既知のマウス由来抗体）―抗原（一次抗体と反応する抗原陽性赤血球）―二次抗体（抗KANNO）でサンドウィッチし、サンドイッチされた場合に発色するイメージです。KANNO陰性赤血球を用いた場合は、二次抗体の抗KANNOが結合しないため、ペルオキシダーゼ標識抗体は結合せず、その結果発色もしません。今回の解析検討では、抗PRNPの他に抗DAF、抗Kell、抗GPCなどを使用し、KANNO抗原陽性と陰性の赤血球を用いて解析を行っています。その結果、KANNO陽性と陰性の赤血球で差が出たのは、抗PRNPを使用した場合のみでした。つまり、抗PRNPはKANNO陽性とは反応するがKANNO陰性とは反応しないということになります［SL.1］。他の抗DAF、抗Kell、抗GPCなどは、KANNO陽性及び陰性赤血球と反応するものの、その後に感作する抗KANNOとは反応しないため発色が起こりません。こうして、抗KANNOが認識する分子は抗PRNPと反応する蛋白（＝プリオン蛋白）であることが証明されました。
次にPRNP遺伝子をCHO-K1細胞（Chinese Hamster Ovary：チャイニーズハムスターの卵巣細胞）に遺伝子導入し発現実験した結果です［SL.2］。PRNP遺伝子の655番塩基をグアニン（PRNP*655G）にしたKANNO陽性タイプが①と②です。一方、PRNP遺伝子の655番塩基をアデニン（PRNP*655A）にしたKANNO陰性タイプが③と④です。①と③はプリオン遺伝子に組み込んだ緑色の色素のみの発色であり、CHO-K1細胞にPRNP遺伝子が組み込まれたことを意味します。②と④には抗KANNOを結合し、その後赤い色素で架橋した様子です。KANNO＋の遺伝子を組み込んだ②は赤の発色が確認され、プリオン蛋白に発現しているKANNO抗原と反応していることが分かります。一方、④のPRNP*655AにしたKANNO-タイプでは、抗KANNOとは反応しないため、赤の発色はありません。つまり、プリオン遺伝子の655番目の塩基の違いでKANNO抗原の発現が異なることがわかり、PRNP*655Gの場合にのみ抗KANNOとの反応が確認できたことになります。PRNP遺伝子の655番目の塩基の違いは、219番目のアミノ酸がグルタミン酸（Glu：E）からリジン（Lys：K）になるため、抗KANNOは219番目がグルタミン酸型のプリオンと反応し、219番目がリジン型プリオンとは反応しないという結論になります。こうして、KANNO抗原分子の実験的証明がされました。
＊抗PrP＝抗PRNP
